基因編輯會(huì)不會(huì)脫靶？中國(guó)科學(xué)家用最新研究給出解答

自從以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)被發(fā)明以來(lái)，有一個(gè)詞就像幽靈般盤(pán)旋在這個(gè)領(lǐng)域中，那就是“脫靶” 。人人都討論它，人人都害怕它，但卻沒(méi)人看得到它。
　　然而在昨天 ，這個(gè)幽靈終于被人抓住了，中科院神經(jīng)所楊輝實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)與合作者開(kāi)發(fā)了一套名為GOTI的新技術(shù) ，讓基因編輯的脫靶從此無(wú)所遁形 ，相關(guān)論文發(fā)表在3月1日的《科學(xué)》（Science）上['1']。

GOTI新技術(shù)讓基因編輯的脫靶從此無(wú)所遁形。

　　一槍打在了別人的靶子上
　　在2004年雅典奧運(yùn)會(huì)男子50米步槍三姿決賽中，美國(guó)選手埃蒙斯遙遙領(lǐng)先 ，到了要打最后一槍的時(shí)候，他已然遙遙領(lǐng)先第二名整整三環(huán) 。勝卷在握的他屏息凝神開(kāi)了這一槍 ，又一次把子彈準(zhǔn)確送到了差不多是靶心的位置，然而他的記分牌上卻顯示出一個(gè)匪夷所思的成績(jī)：
　　脫靶。
　　原來(lái)埃蒙斯犯了一個(gè)莫名其妙的錯(cuò)誤——他最后一槍打在了別人的靶子上 。
　　埃蒙斯 ：我怎么會(huì)……圖片來(lái)源：GETTY IMAGES埃蒙斯：我怎么會(huì)……圖片來(lái)源：GETTY IMAGES
　　奧運(yùn)會(huì)的頂尖選手如此 ，生命科學(xué)的頂尖技術(shù)亦是如此 。
　　近年來(lái)很火的技術(shù)“基因編輯”，就有這個(gè)問(wèn)題 。盡管以CRISPR/Cas9等為代表的新一代基因編輯以精確著稱，但它們時(shí)不時(shí)就是會(huì)犯這種“打到別人靶子上”的毛病——香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站本來(lái)要讓它去編輯A基因 ，但它卻意外搞壞了B基因。
　　基因編輯的脫靶和奧運(yùn)選手的脫靶一樣都是極小概率的事件 ，但常在河邊走哪能不見(jiàn)鬼 ，每一次基因編輯操作，本質(zhì)上都是成千上萬(wàn)的基因編輯工具對(duì)著成千上萬(wàn)的細(xì)胞做了成千上萬(wàn)次編輯 ，焉能保證次次不失手呢？
　　奧運(yùn)選手脫靶最多丟塊金牌 ，基因編輯脫靶了 ，丟的沒(méi)準(zhǔn)就是性命了。然而基因編輯技術(shù)宛如一輛勢(shì)不可擋的戰(zhàn)車(chē)，正以雷霆萬(wàn)鈞之勢(shì)向著臨床領(lǐng)域疾馳而來(lái)。
　　然而這歷史的車(chē)輪真的不能擋嗎？又該不該擋一下呢？
　　查明脫靶率可沒(méi)那么容易
　　還是拿奧運(yùn)會(huì)打個(gè)比方吧 ，雖然奧運(yùn)選手脫靶是個(gè)小概率事件 ，但是只要觀察的次數(shù)足夠多 ，就能夠統(tǒng)計(jì)出他平均中靶多少次會(huì)出現(xiàn)一次脫靶，這個(gè)就是就叫做“脫靶率” 。
　　知道了脫靶率 ，香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站才能制定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。比如說(shuō)規(guī)定平均一萬(wàn)槍內(nèi)不能出現(xiàn)超過(guò)一次脫靶，張三脫靶率是千分之一 ，那他就不合格 ；李四脫靶率千萬(wàn)分之一 ，那他就值得信賴。
　　然而頗顯尷尬的是 ，這么多年來(lái)，無(wú)論是支持基因編輯脫靶還是反對(duì)基因編輯脫靶 ，大家很大程度都只憑著一種“信仰”，卻從來(lái)沒(méi)有人真正弄清過(guò)基因編輯的脫靶率到底是多少。
　　這是因?yàn)?，基因編輯的脫靶率真的太難檢測(cè)了 。
　　射擊運(yùn)動(dòng)員的脫靶率可以直接“數(shù)”出來(lái) ，基因編輯的脫靶率該怎樣計(jì)算呢 ？也許有人會(huì)說(shuō) ，這很簡(jiǎn)單呀 ，把一批樣本分成兩組 ，一組做基因編輯 ，一組不做 ，然后比對(duì)一下兩組的基因差異不就成了么 ？
　　2017年 ， Bassuk等幾位科學(xué)家還真就這么干了['2']，他們用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯了幾枚小鼠的受精卵 ，等這些受精卵發(fā)育成小鼠出生后檢測(cè)了它們的基因，并將其與同一品系的其它小鼠作對(duì)比 ，結(jié)果居然發(fā)現(xiàn)了“一千多處難以預(yù)料的基因突變” 。
　　盡管這個(gè)結(jié)果立馬成了各大媒體的頭條，但它卻受到了學(xué)術(shù)圈內(nèi)一致的口誅筆伐，因?yàn)檫@個(gè)檢測(cè)犯了一個(gè)很低級(jí)的錯(cuò)誤 ：世界上沒(méi)有兩只基因完全一樣的小鼠。Bassuk的實(shí)驗(yàn)無(wú)法區(qū)分比對(duì)出來(lái)的基因差異究竟來(lái)自于基因編輯 ，還是小鼠之間本來(lái)就有的個(gè)體差異。
　　在一片指責(zé)聲中，來(lái)自中科院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝實(shí)驗(yàn)室的博士后左二偉（還記得嗎 ？就是那個(gè)敲染色體的 CRISPR又有新用場(chǎng)了 ！這或許是唐氏綜合征患者的福音 ）卻萌生了一個(gè)清奇的想法 ，當(dāng)時(shí)他一拍大腿說(shuō)，艾瑪好機(jī)會(huì)啊 ，只要立刻用非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)方法重做一下論文的工作，然后得出否定的結(jié)論反駁它 ，不就白撿一篇Nature methods嘛 。
　　做著做著 ，他就發(fā)現(xiàn) ，這個(gè)“非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)方法”其實(shí)并不簡(jiǎn)單（不然早幾年全世界的科學(xué)家不就早該做了么） 。更慘的是 ，他的工作鋪開(kāi)沒(méi)過(guò)多久 ，Bassuk的論文就被撤稿了（詳情請(qǐng)見(jiàn)：震驚！國(guó)際頂尖期刊宣布CRISPR有毒！震驚again ！它又撤稿了 ?。?。
　　不過(guò) ，左二偉博士還是決定研究下這個(gè)問(wèn)題，世界上不是有一句魔咒叫做“來(lái)都來(lái)了”嘛 ，順便做做看吧……
　　經(jīng)過(guò)與導(dǎo)師的討論，一個(gè)可以精準(zhǔn)檢測(cè)脫靶的方案還真的慢慢成型了。然而正是在左二偉博士“順便”研究脫靶問(wèn)題的這段時(shí)間里，基因編輯臨床化的腳步卻在日益加快。
　　2018年1月 ，美國(guó)批準(zhǔn)了賓州大學(xué)一項(xiàng)利用CRISPR/Cas9修復(fù)免疫缺陷的臨床試驗(yàn) 。
　　2018年8月 ，歐洲多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)了張鋒的CRISPR Therapeutics公司的用CRISPR/Cas9治療β地中海貧血癥的臨床試驗(yàn)。
　　2018年11月 ，解放軍總醫(yī)院的基于基因編輯T細(xì)胞治療癌癥的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)也被通過(guò) 。
　　更遑論2018年11月份 ，原南方科技大學(xué)副教授賀建奎公然宣布自己做出了人類(lèi)首例基因編輯嬰兒 。細(xì)思極恐的是 ，賀建奎之后，居然還有不少力挺他的聲音 ，其中不乏國(guó)際最頂尖的科學(xué)家 。
　　張鋒和David Liu等等也是極大地加快了基因編輯臨床化的速度 。
　　畢竟 ，誰(shuí)第一個(gè)取得了臨床化基因編輯的突破，誰(shuí)就率先霸占了一塊醫(yī)療的制高點(diǎn) ，這其中的利益真的太誘人了 。乃至一時(shí)之間萬(wàn)馬奔騰，有些人似乎已經(jīng)不在乎這其實(shí)還是一項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)未知的技術(shù)了。
　　突然之間 ，左二偉博士乃至整個(gè)楊輝實(shí)驗(yàn)室都好像無(wú)意中站在了歷史的節(jié)點(diǎn)上，這個(gè)隨手做做的課題突然將會(huì)變得足以決定這個(gè)領(lǐng)域的歷史走向——
　　檢測(cè)出來(lái)如果證明基因編輯不易脫靶當(dāng)然皆大歡喜，但如果證明它容易脫靶呢？且不說(shuō)楊輝自己實(shí)驗(yàn)室里那些涉及基因編輯向臨床轉(zhuǎn)化的課題將面臨考驗(yàn) ，還可能由此在行業(yè)內(nèi)掀起一場(chǎng)地震。
　　最終 ，左二偉博士在與導(dǎo)師楊輝研究員以及所長(zhǎng)蒲慕明等人商議后，大家還是決定繼續(xù)做下去 ，畢竟……
　　得有人站出來(lái)承擔(dān)這個(gè)責(zé)任呀 。
　　檢測(cè)脫靶，阻礙重重
　　阻礙檢測(cè)脫靶率的，除了“個(gè)體差異”外 ，還有另一個(gè)障礙 。
　　什么障礙呢 ？香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站繼續(xù)用射擊做比方 ：能得分的目標(biāo)靶子通常是唯一的，而目標(biāo)外的“別人家的靶子”可就是千千萬(wàn)萬(wàn)各有不同了。想象一下 ，如果隨便撒一把CRISPR/Cas9去編輯十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的基因 ，假設(shè)每個(gè)都脫靶 ，且這些脫靶都是隨機(jī)產(chǎn)生的 ，那么這十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞最多就會(huì)有十萬(wàn)種脫靶 ，每一種脫靶形式只占了所有樣本的十萬(wàn)分之一 ，這種微乎其微的異常幾乎不可能被檢測(cè)出來(lái)。
　　因此 ，脫靶檢測(cè)需要依賴所謂的“單細(xì)胞測(cè)序” ，通俗來(lái)說(shuō)，就是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都只有一個(gè)細(xì)胞。這樣的對(duì)比當(dāng)然就能很容易發(fā)現(xiàn)差別，但是很顯然 ，一個(gè)細(xì)胞那一丁點(diǎn)DNA是根本不夠拿來(lái)檢測(cè)的。為了解決這個(gè)矛盾 ，就要用到“體外擴(kuò)增”技術(shù)，把那一丁點(diǎn)DNA樣本復(fù)制成千上萬(wàn)份，直到數(shù)量滿足檢測(cè)所需為止 。
　　但是 ，人類(lèi)發(fā)明的任何體外擴(kuò)增體系都是不完美的 ，無(wú)法做到100%精確拷貝最初的DNA樣本，每一次復(fù)制都會(huì)帶入一丁點(diǎn)錯(cuò)誤 。就像復(fù)印文稿總比原稿品質(zhì)差一些一樣 ，經(jīng)過(guò)千萬(wàn)次復(fù)制再?gòu)?fù)制 ，就足以讓這份DNA樣本變得面目全非，干擾檢測(cè)結(jié)果 。
　　這一切引入的“噪音”甚至比脫靶信號(hào)本身還要高出好幾個(gè)數(shù)量級(jí) ，這宛如是在汪洋大海中尋找一滴水一般。
　　一舉三得該如何實(shí)現(xiàn) ？
　　找到這滴水的唯一辦法就是讓大海（各種干擾因素）消失。左二偉博士與導(dǎo)師楊輝還真的想到了一種絕妙的方式，同時(shí)解決了這三個(gè)問(wèn)題。
　　為了避免個(gè)體差異，香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站又需要找到兩個(gè)基因一模一樣的細(xì)胞 ，為了凸顯脫靶的信號(hào) ，香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站又需要用到“單細(xì)胞測(cè)序” ，然后香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站還不能用體外擴(kuò)增來(lái)復(fù)制這兩個(gè)細(xì)胞的DNA ，卻又需要很大量的DNA樣本來(lái)做測(cè)序分析 。
　　首先最容易解決的就是找兩個(gè)基因完全一模一樣的細(xì)胞 。香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站知道 ，多數(shù)動(dòng)物都是從一個(gè)受精卵發(fā)育而來(lái)的 ，這個(gè)受精卵一分為二，二分為四……等等，在它一分為二的時(shí)候 ，香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站稱之為“二細(xì)胞期胚胎”階段，不就是兩個(gè)現(xiàn)成的基因一模一樣的細(xì)胞嗎 ？

　　只要向其中一個(gè)注射基因編輯工具，另一個(gè)就是世界上最佳的對(duì)照。

　　其次 ，一個(gè)細(xì)胞的DNA不是不夠檢測(cè)么？沒(méi)關(guān)系 ，注射完畢后香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站直接把這個(gè)二細(xì)胞胚胎植入母鼠的子宮當(dāng)中 ，讓它正常發(fā)育，這樣得到的小鼠胚胎中 ，理論上就有一半細(xì)胞經(jīng)歷過(guò)基因編輯 ，另一半則沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)過(guò) 。
　　這時(shí)候 ，左二偉博士直接將發(fā)育長(zhǎng)大的小鼠胚胎取出來(lái)，用一些特殊的酶消化成一大堆分散的細(xì)胞。利用一些方法 ，香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站可以追蹤當(dāng)時(shí)那兩個(gè)細(xì)胞的后代，從這一堆細(xì)胞中將它們倆各自的后代分成兩撥 。由于這兩撥細(xì)胞也是之前的細(xì)胞分裂而來(lái)，所以它們的基因就相當(dāng)于是最初那個(gè)細(xì)胞的復(fù)制品 。
　　這也順便解決了第三個(gè)問(wèn)題 ，裂解掉這一大堆足以構(gòu)建出半個(gè)小鼠胚胎的巨量細(xì)胞 ，一次性就能提取到足夠測(cè)序分析的DNA，從而避免了體外擴(kuò)增帶來(lái)的噪音。
　　在神經(jīng)所蒲慕明所長(zhǎng)的建議下，研究團(tuán)隊(duì)將這套系統(tǒng)命名為GOTI 。可以說(shuō)，這套系統(tǒng)的推出 ，標(biāo)志著人們終于得以用數(shù)字來(lái)衡量基因編輯的脫靶率。

　　GOTI的技術(shù)流程 ：在二細(xì)胞期向一個(gè)卵裂球注射基因編輯工具 ，并用CRE使之本身以及后代細(xì)胞都發(fā)出紅色熒光 。等小鼠胚胎發(fā)育到14.5天后取出母體 ，利用流式細(xì)胞儀將兩個(gè)卵裂球的后代分開(kāi) ，并各自全部消化掉提取DNA來(lái)做測(cè)序分析 。
　　哪種基因編輯易脫靶 ？香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站挨個(gè)測(cè)一下
　　終于到了檢測(cè)工具一顯身手的時(shí)候 。它接下來(lái)要幫助人們回答的關(guān)鍵問(wèn)題就是 ：那些常見(jiàn)的基因編輯工具真的會(huì)脫靶嗎 ？在GOTI的神威下，一切清晰了起來(lái) 。
　　首先，值得慶幸的是 ，最經(jīng)典的spCas9系統(tǒng)經(jīng)受住了考驗(yàn)。結(jié)果顯示，它引起異?；蛲蛔兊目赡苄圆桓哂谛∈笞陨砑?xì)胞分裂帶來(lái)的本底基因突變。就是說(shuō)，從目前的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看它是安全的 。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為目前最方便的基因編輯工具 。圖片來(lái)源 ：origene.com

　　與此同時(shí)最令人大跌眼鏡的發(fā)現(xiàn)是 ，另一類(lèi)叫做單堿基突變系統(tǒng)（Base Editor）的基因編輯工具有著異常高的脫靶率 。所謂的單堿基突變系統(tǒng)，大致上可以理解為香港馬買(mǎi)馬網(wǎng)站先設(shè)計(jì)一個(gè)只能精確靶向但不會(huì)切割DNA的Cas9蛋白，然后讓這個(gè)Cas9蛋白牽著一個(gè)能夠通過(guò)化學(xué)方法將某個(gè)堿基定向突變（比如A→T）的酶來(lái)給DNA鏈中引入點(diǎn)突變。
　　原本這套系統(tǒng)因?yàn)椴粫?huì)引入DNA斷裂 ，被視為特別安全的一類(lèi)基因編輯技術(shù) ，人們從來(lái)不覺(jué)得它會(huì)脫靶 ，之前的脫靶檢測(cè)也完全沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它有任何脫靶的跡象 。因此以劉如謙（David Liu）等為代表的一群科學(xué)家長(zhǎng)期都在致力于將這項(xiàng)技術(shù)作為基因編輯向臨床進(jìn)軍的急先鋒。

　　通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) ，經(jīng)典的CRISPR/Cas9并沒(méi)有顯著的脫靶現(xiàn)象 ，但是單堿基編輯系統(tǒng)BE3則出現(xiàn)了高出背景基因突變水平數(shù)倍的脫靶現(xiàn)象 。
　　這時(shí)候研究團(tuán)隊(duì)才突然意識(shí)到 ，就算Cas9沒(méi)有在sgRNA帶領(lǐng)下跟任何DNA序列結(jié)合，那個(gè)能夠引起堿基定向改變的酶也依舊存在，它完全可以像任何在細(xì)胞里游離的酶一樣 ，讓任何偶然接觸自己的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。這樣的系統(tǒng)天然就有高脫靶率的 ，可能之前大家對(duì)“沒(méi)有DNA鏈斷裂就沒(méi)有脫靶”形成了思維定勢(shì) ，才會(huì)忽視這一安全漏洞。
　　長(zhǎng)久以來(lái) ，因?yàn)槿鄙倭钏腥硕夹欧拿摪袡z測(cè)技術(shù)，基因編輯的脫靶問(wèn)題被吵吵嚷嚷了五年多 ，也讓這個(gè)領(lǐng)域在此期間一直處于野蠻生長(zhǎng)的狀態(tài) 。
　　如今，GOTI出現(xiàn)了 ，規(guī)則還會(huì)遠(yuǎn)嗎？

來(lái)源：我是科學(xué)家iScientist
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